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DPCR檢測試劑盒開發(fā)性能驗(yàn)證

發(fā)布時(shí)間:2025/04/25分類:技術(shù)文章來源:科佰生物

描述

 

 

數(shù)字PCR(DPCR)是一種核酸定量技術(shù),能夠在單分子水平上對DNA或RNA進(jìn)行絕對定量。與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)相比,DPCR具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性,因此在生物學(xué)研究和臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用。



 DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用 

 

 
 

DPCR腫瘤領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用:

 

檢測Gene Expression,主要是檢測mRNA的定量分析;

 

檢測Mutation(SNV和Indel),可以檢測拷貝數(shù),也可以檢測比率;

 

檢測CNV(拷貝數(shù)變異分析),相對定量; 

 

檢測Fusion,可以檢測拷貝數(shù),也可以檢測比率;

 

 

 

科佰生物

科佰生物針對以上應(yīng)用開發(fā)對應(yīng)的檢測試劑盒,配套科佰生物的參考品,對試劑盒做性能評價(jià),如下我們以EGFR T790M為例:

 

 

實(shí)驗(yàn)一:LOB空白限測試

 

 

 

待測樣本:20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設(shè)置為10ng和40ng,每個(gè)樣本做兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見:無論是10ng還是40ng,LOB控制在2拷貝以內(nèi)(一般噪音拷貝為5以內(nèi)),雜點(diǎn)不呈現(xiàn)劑量的依賴,是隨機(jī)產(chǎn)生的噪音信號。

 

 

實(shí)驗(yàn)二:準(zhǔn)確性測試

 

 

 

待測樣本:10個(gè)NGS驗(yàn)證為陽性的樣本(編號1-10);  10個(gè)NGS驗(yàn)證為陰性的樣本(編號11-20)。對20個(gè)樣本分別使用數(shù)字PCR檢測。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見:

①測試10個(gè)NGS陽性樣本,檢測結(jié)果均為陽性,陽性符合率100%,并定量檢出變異頻率。

②測試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測結(jié)果均為陰性,陰性符合率100%,定值變異頻率均為0%。

 

 

實(shí)驗(yàn)三:線性范圍測試

 

 

 

1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測試

首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402),該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過理論值計(jì)算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗(yàn)證,確認(rèn)為50%的頻率。

 

1.1 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(2復(fù)孔),分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān);

 

1.2 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(2復(fù)孔),判斷是否滿足%AF=50±10%波動(dòng)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見:

200 ng投入量過大,拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,雖然滿足45-55%范圍,但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定;

0.1 ng投入量過小,拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,同時(shí)42.59%也低于45%,不適合做單一通道,也不適合做雙通道;

因此:范圍為0.5-100ng。

 

2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線性測試

根據(jù)以上結(jié)論,我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線性范圍探索,首先使用EGFR T790M的對應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品,對50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋,0.1%-50%間設(shè)置9個(gè)AF梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(2復(fù)孔)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見:在10ng的投入量下,AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋,存在波動(dòng),但是都在誤差范圍內(nèi)。

 

 

實(shí)驗(yàn)四:檢測限測試

 

 

 

我們可以通過理論計(jì)算來預(yù)測下可能的檢測限范圍。當(dāng)控制拷貝在15000(對應(yīng)50ng input)以內(nèi)時(shí)LOB數(shù)據(jù)是2,2/15000=0.0133%,預(yù)測檢測限為0.0200%。

 

在如此低頻的情況下,臨床適用場景適合ctDNA,一般來說臨床上10ml全血,一般中位值ctDNA是20-40ng,取最低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數(shù),2/6000=0.0333%,預(yù)測檢測限為0.0500%。

 

0.05%的誤差范圍是±50%,就是0.025-0.075%,因此我們選擇3個(gè)點(diǎn),探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%,要求95%檢出。

 

0.010%  

對20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測,觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

 

0.05%  

對20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測,觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

0.1%  

對20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測,觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

 

由上數(shù)據(jù)可見:選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。

 

 

實(shí)驗(yàn)五:精密度測試

 

 

 

選取強(qiáng)陽性2%樣本20個(gè),中陽性1%樣本20個(gè),弱陽性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數(shù)字PCR檢測。

 

由上數(shù)據(jù)可見:強(qiáng)陽性2% 、中陽性1% 、弱陽性0.2%三種檢測體系下,誤差均在合理的范圍內(nèi),精密度良好。

 

 

實(shí)驗(yàn)六:回收率測試

 

 

 

首先使用EGFR T790M的對應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品,對50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋,每個(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋,接著對11個(gè)樣本進(jìn)行檢測。

 

由上數(shù)據(jù)可見:當(dāng)AF在0.05%-50%范圍內(nèi),對應(yīng)的回收率在80-120%范圍,符合預(yù)期。

 

 

實(shí)驗(yàn)七:重復(fù)性測試

 

 

 

取10個(gè)不同AF(1%~50%)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,分別安排實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天,每人進(jìn)行四次檢測。

 

由上數(shù)據(jù)可見:EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的檢出的。

 

 

實(shí)驗(yàn)八:重現(xiàn)性測試

 

 

 

取10個(gè)不同AF(1%~50%)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,分別安排①實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗(yàn)測試;②實(shí)驗(yàn)員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試;③實(shí)驗(yàn)員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試,實(shí)驗(yàn)員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測試。

由上數(shù)據(jù)可見:EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的在不同人、不同時(shí)間檢出,重現(xiàn)的。

 

      科佰生物已經(jīng)開發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系,并利用自身的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了性能驗(yàn)證??捎糜诨蛲蛔?,融合,拷貝數(shù)變異等的檢測。同時(shí),我們可以提供dPCR檢測的科研服務(wù),基于其絕對定值、精準(zhǔn)定量的強(qiáng)大優(yōu)勢,為客戶的樣本檢測提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。

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