▏ 服務(wù)原理

慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因(或RNAi)導(dǎo)入動物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白;或產(chǎn)生RNAi干擾。

慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

慢病毒載體不表達(dá)任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響病毒載體的第2次注射。

▏ 服務(wù)簡介

慢病毒( Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，為RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于對HIV-1的研究最廣泛最深入，對其生物學(xué)特性最為了解，因此HIV-1來源的慢病毒載體已成為其中的代表。



HIV-1為雙鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因，如圖1所示。gag、pol、env3個(gè)基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev為調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef 4個(gè)為輔助基因。其中，gag基因編碼病毒的核心蛋白，包括基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白;pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性。rev編碼的蛋白調(diào)節(jié)gag、pol、env的表達(dá)水平，tat編碼的蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄的控制。4個(gè)輔助基因編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識別和感染。兩端為長末端重復(fù)序列(LTR)，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，如包裝信號元件Ψ。

第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表，該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝質(zhì)粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)表達(dá)gag和pol，另一個(gè)表達(dá)env。載體質(zhì)粒攜帶了5’端LTR，和全部5’端非翻譯區(qū)域，另外還帶有rev應(yīng)答元件(RRE)。包膜表達(dá)質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒的env基因。

第二代慢病毒載體系統(tǒng)是在第一代的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，在包裝質(zhì)粒中刪除了HIV的所有輔助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。這些附屬基因的去除并不影響病毒的滴度和感染能力，同時(shí)增加了載體的安全性。

第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。將rev基因單獨(dú)放在一個(gè)包裝質(zhì)粒上。同時(shí)又增加了兩個(gè)安全特性：一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3′LTR，使載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA;二是去除了tat基因，用異源啟動子序列代替，這樣原始的HIV-1基因組中的9個(gè)慢病毒載體中只保留了3個(gè)(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒載體系統(tǒng)更加安全。

▏ 服務(wù)優(yōu)勢

能將外源基因有效整合入宿主染色體，外源基因表達(dá)水平較高、表達(dá)穩(wěn)定;
廣泛的宿主，可感染分裂和不分裂的細(xì)胞，幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞，特別適合質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞;
適用范圍廣，可用于體外細(xì)胞系和活體動物模型，研究基因和RNAi等;
轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，不需要轉(zhuǎn)染試劑，目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的概率大大增加。

科佰生物擁有豐富的病毒包裝經(jīng)驗(yàn)，成功為很多客戶包裝出需要的病毒，并且完成相應(yīng)的功能檢測

▏ 服務(wù)流程

1）獲得目的基因序列;
2）構(gòu)建慢病毒載體;
3）重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，包裝病毒;
4）病毒純化、濃縮;
5）滴度測定。
6）對照組和實(shí)驗(yàn)組感染細(xì)胞，利用抗生素篩選，得到穩(wěn)定單克隆細(xì)胞株(可選)。

▏ 案例展示

▏ 服務(wù)說明

1）客戶提供目的基因的序列，如果提供模板，請告知載體、酶切穩(wěn)點(diǎn)等信息;
2）若實(shí)驗(yàn)材料為原代細(xì)胞或者特殊培養(yǎng)的細(xì)胞，請先咨詢;
3）公司默認(rèn)提供病毒滴度為1x107-1x108TU/ml,規(guī)格1ml;
4）目的蛋白的功能驗(yàn)證另外收費(fèi)。