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突變頻率AF的稀釋：野生型不含突變的細胞系核酸與含有特定突變的細胞系核酸進行混合，對于AF突變頻率的稀釋通常不能簡單考慮野生型核酸及突變核酸的質(zhì)量比，而需要突變基因位點的原始頻率，突變及野生型基因核酸所含的目的基因拷貝數(shù)，野生及突變型核酸樣本的基因組整體分子量（染色體倍性）等多個維度進行考慮，科佰生物開發(fā)了一套獨特的算法，將上述因素均納入該計算方法中，使得計算的理論突變及野生型核酸混合比例最大程度的精確，同時對稀釋后的樣品進行數(shù)字PCR絕對定量，再根據(jù)定量的結果對與理論AF%值有一定偏差的結果進行微調(diào)以后再次數(shù)字PCR定量，使得稀釋樣品的AF%處于使用預期的合理范圍內(nèi)濃度的稀釋：一般gDNA濃度在40ng/ul，如果需要低濃度，那么使用對應的緩沖液對產(chǎn)品進行稀釋。

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科佰的突變頻率AF是通過數(shù)字PCR檢測的，誤差范圍如下：

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AF檢測結果不符合預期的原因可能是多方面，通常有以下幾個常見的原因，1）技術平臺方法學的差異，COA呈現(xiàn)的AF值及誤差范圍是基于數(shù)字PCR絕對定量計算的結果，當標準品用其它方法學檢測時(例如NGS),這種AF的偏差可能被放大，這種放大又和檢測突變的類型，目的基因的拷貝數(shù)及序列的特殊性，樣本的染色體倍性，具體采用的實驗技術路線，以及后期的生信分析方法相關，具體來說1）當突變?yōu)镾NV時一般數(shù)字PCR與NGS獲得的AF值偏差較小，而CNV及融合突變的AF值偏差較大，從實驗的角度數(shù)字PCR是完整的gDNA樣品進行一個擴增定量，而NGS建庫過程中往往需要對樣品進行打斷，打斷通常容易使CNV及融合突變的AF與打斷前發(fā)生一定的偏差，我們用數(shù)字PCR對打斷前后的CNV及融合突變樣品檢測往往也會觀察到這個現(xiàn)象，這種打斷以后產(chǎn)生的差異我們在一些整體染色體倍性異常的樣品上也有所發(fā)現(xiàn), 另外從檢測后的生信分析角度來看，SNV AF值的計算分析方法相對成熟統(tǒng)一，也更接近于數(shù)字PCR AF值的計算原理，所以NGS和數(shù)字PCR結果之間往往差異較小，而CNV和融合突變的AF計算更依賴于生信算法，方案不太統(tǒng)一成熟，各家算法差異較大，這也是導致其與數(shù)字PCR定標AF存在較大差異的原因之一。此外，從方法學角度，數(shù)字PCR只是簡單的一次PCR的絕對定量方法，而NGS方法無論是擴增子還是捕獲方案，建庫及測序過程中可能都涉及多次或多重PCR，PCR的過程會產(chǎn)生一些偏向性擴增，導致AF值發(fā)生一定偏離，我們也曾通過一些數(shù)字PCR實驗驗證發(fā)現(xiàn)某些樣本和位點建庫前和建庫后的PCR產(chǎn)物AF值存在差異；另外，某些NGS測序深度不足或者不均一也會導致AF值與預期不符，例如某些GC含量過高或過低的區(qū)域位點，可能會存在深度與其它區(qū)域比不均一的情況，導致AF偏離， 另外對于某些拷貝數(shù)擴增，且擴增數(shù)比較高的位點，會存在局部測序深度不夠，導致檢測上限低于真實拷貝數(shù)，需要更高的測序深度才能反映真實的拷貝數(shù)。

以上只是一些常見的AF值偏離的原因，總而言之，AF值不符的原因是多方面且復雜的，具體案例還需要具體分析，當遇到實際案例時可能我們需要客戶的一些原始數(shù)據(jù)和實驗細節(jié)才能便于我們分析原因。

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科佰生物的標準品來源的細胞系是含有一些內(nèi)源性突變的，這些突變的全外顯子測序結果可以在購買后咨詢我們的銷售人員獲取。

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160bp±10%的DNA片段，模擬液體活檢病人樣本；由①gDNA超聲打斷或②酶切處理染色體后提取獲得；可提供純化后的ctDNA片段，也可以將ctDNA 按一定的濃度溶入人工血漿中模擬臨床上未純化的血漿樣本，我們一般不對產(chǎn)品提供末端修復，客戶可根據(jù)自己的應用場景需要自行進行修復。

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FFPE標準品是將一定數(shù)量的特定突變細胞福爾馬林固定，包埋形成石蠟塊形式；石蠟塊切片制作為石蠟切片形式。

試劑盒：

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)

Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 

規(guī)格提取量：>400 ng per two slides with 15 μm/slide

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參考 從《指導原則》中分析參考品盤設計

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1）數(shù)字PCR的引物探針針對SNV，或者較短的Indel (如EGFR 19Del, 20Ins等)，通常包含一對引物，以及兩條分別標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針用于識別突變及野生型拷貝數(shù)。

2）數(shù)字PCR的引物探針針對CNV,通常包含兩對不同的引物及兩條標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴增識別定量目的基因及內(nèi)參基因的拷貝數(shù)。（內(nèi)參基因一般選擇較為保守不易發(fā)生拷貝數(shù)變異的基因，例如RPP30，盡管內(nèi)參基因拷貝數(shù)相對保守，不易發(fā)生拷貝數(shù)異常，但這不是絕對的，有時為了提高檢測的準確性，可以考慮選擇兩到三個不同的內(nèi)參基因來比較，提高檢測的準確性）。

3）數(shù)字PCR的引物探針針對DNA融合突變，通常包含兩對不同的引物及兩條標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴增識別定量目的基因突變BREAKPOINT拷貝數(shù)及總的目的基因拷貝數(shù)。

4）數(shù)字PCR的引物探針針對RNA，通常包一對引物及一條標記熒光基團的探針，用于擴增識別定量目的基因拷貝數(shù)。